Agrobacterium, מגורם מחלה להנדסה גנטית

על שורשיהם של צמחים רבים, לרוב במקום המפגש עם הגבעול (צוואר השורש), שהוא רגיש לפציעה כתוצאה מהחיכוך באדמה, מתפתחים לעתים גידולים המכונים "עפצי צוואר השורש" (Crown galls). גידולים אלה נובעים מהתרבות לא-מבוקרת של תאים. כתוצאה מהתפתחות העפץ, נפגעת הצמיחה הטבעית של הצמח, והוא אף עלול למות. גידולים חקלאיים רבים, כעגבניות, ורדים, וגפנים, נפגעים מעפצים אלה, ולכן היה עניין רב באיתור הגורם לבעיה.

עפץ על גזע של ארז אדום מזרחי (Juniperus virginiana), בפלורידה, ארצות הברית
Edward L. Barnard, Florida Department of Agriculture and Consumer Services, Bugwood.org

איתור גורם המחלה

בשנת 1897, בנפולי שבאיטליה, בודד פרידיאנו קווארה (Cavara) חיידק מגפנים וקרא לו Bacterium tumefaciens. בשנת 1907 קישרו ארווין סמית Smith)) וצ'רלס טאונסנד (Townsend) בין המחלה לחיידק. הם גילו שהמחלה והחיידק קיימים רק בצמחים דו-פסיגיים (כעגבנייה, גזר וגפנים), ולא בחד-פסיגיים (כחיטה, אורז ותירז). בהמשך שונה שם החיידק ל-Agrobacterium tumefaciens.

זה לא החיידק עצמו - זה משהו שהחיידק עושה

ארמין בראון (Braun), ממכון רוקפלר בניו-יורק, הוא שגילה, בשנות הארבעים של המאה ה-20, שגם אם מסלקים את החיידקים מהעפץ, העפץ ממשיך להתפתח - החיידקים גרמו לתאי הגידול שינוי בלתי הפיך. (בראון הצליח לעשות זאת לפני עידן האנטיביוטיקה: הוא הדביק צמחי וינקה בחיידקים, ולאחר כמה ימי גידול בטמפרטורה רגילה, העביר אותם לימים אחדים לטמפרטורה של 45°C, שבה החיידקים אינם שורדים, אך הצמחים נשארים בחיים. אחר-כך החזיר את הצמחים לטמפרטורה הרגילה.) בראון גם ראה שתאי הגידול, בניגוד לתאי צמח רגילים, גדלים במעבדה במצע חסר הורמונים צמחיים (אוקסין, auxin, וציטוקינין, cytokinin) ואז התברר לו, להפתעתו, שתאי הגידול מייצרים את ההורמונים בעצמם.

מעבר של DNA חיידקי לתאי הצמח

מאוחר יותר, בשנות השישים, גילה החוקר הצרפתי ג'ורג מורל (Morel) שתאי העפץ מפרישים לסביבתם חומרים ייחודיים שאינם נוצרים בתאי צמח רגילים. חומרים אלה כונו אופּינים (Opines). מורל מצא שסוג האופּין תלוי בזן החיידקים. יש חיידקים המשרים את יצירת האופין נוֹפָּלין (תרכובת של ארגינין וקֶטוֹגְלוּטרט), ואילו אחרים - אוקטופין (תרכובת של ארגינין ופירובט). כיום מוכָרים אופינים רבים נוספים. האופינים משמשים, למעשה, כמקורות פחמן וחנקן יחודיים לחיידקים שבסביבת הגידול, כך שהחיידקים יצרו, באמצעות השינוי שגרמו בצמח, סביבה נוחה לקיומם. על סמך הייחודיות של זן החיידק והאופין המופרש מהעפץ, שיער מורל שהשינוי נגרם באמצעות העברת חומר גנטי מהחיידקים לצמח.

ב-1971, רוברט המילטון (Hamilton) מאוניברסיטת פנסילבניה חיזק את רעיון העברת ה-DNA בכך שהראה, שכאשר מגדלים חיידקי A. tumefaciens בטמפרטורה גבוהה, הם מאבדים את יכולתם להשרות עפצים בצמחים. המילטון הסיק מניסוייו שמעורב בתהליך פלסמיד, כי באותה עת כבר היה ידוע שאפשר "להירפא" מפלסמידים, אותן מולקולות DNA חוץ-כרומוזומיות מעגליות, בגידול החיידקים בטמפרטורה גבוהה יחסית.

את ההוכחה הסופית לכך, ש-DNA חיידקי אכן מועבר אל תאי הצמח, סיפקו במקביל מחקריהם של יוזף שֶל(Schell) ומארק ואן מונטגו (Van Montagu) וקבוצתו של יוג'ין נסטר (Nester), שקישרו בין היכולת להשרות עפצים לבין נוכחותו של פלסמיד גדול-ממדים, שכונה Ti (ראשי תיבות של Tumor initiation או Tumor inducing - השריית גידול).

הפלסמיד Ti ומערכת ההעברה

Ti הוא פלסמיד גדול יחסית (150,000-200,000 זוגות נוקלאוטידים) הנמצא בזנים משרי העפצים של A. tumefaciens. כאשר חיידקים אלה נמצאים באזור צוואר השורש של צמח, ואזור זה נפצע עקב החיכוך באדמה, תרכובות פנוליות, המופרשות מן הפצע מפעילות גנים הנמצאים באזור מסוים בפלסמיד, המכונה vir (Virulence). החלבונים תוצרי גנים אלה יוצרים מבנה חלבוני מיוחד במעטפת של החיידק הספוח לאזור הפצוע, ומאפשרים מעבר עותק של חלק מסוים של ה-DNA הפלסמידי אל תוך התאים הצמחיים. מערכת העברה זו דומה במבנהּ ובתכונותיה למערכות העברה חיידקיות אחרות, המעורבות בקוניוגציה (העברת DNA מחיידק לחיידק) ובהחדרת רעלנים חלבוניים ומולקולות תקשורת בין חיידקים למאכסניהם.

רצף ה-DNA המועבר, המכונה T-DNA (transferred DNA), משתלב בצורה אקראית באחד הכרומוזומים של תאי הצמח המאכסן. ביטוי הגנים של ה-T-DNA בתאי הצמח הוא הגורם להתפתחות העפץ.

רצף ה-DNA המועבר, המכונה T-DNA (transferred DNA, משתלב בצורה אקראית באחד הכרומוזומים של תאי הצמח המאכסן. ביטוי הגנים של ה-T-DNA בתאי הצמח הוא הגורם להתפתחות העפץ.

מחזור החיים של Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens הוא חיידק קרקע. כאשר צמח נפצע, מופרשים מהפצע אל הקרקע חומרים הגורמים לחיידקים לנוע בתנועה כמוטקטית (תנועה בעקבות גירוי כימי) אל סביבת הצמח. לאחר החדרת ה-DNA החיידקי אל תוך תאי הצמח, משאבי הצמח "מופנים" להתרבותם של תאי הצמח שקלטו את ה-T-DNA, שמהם מופרשים אופינים, וההורמונים הצמחיים אוקסין וציטוקינין. רק החיידקים מסוגלים לנצל את האופּינים כמקורות מזון, ואילו ההורמונים הצמחיים משבשים את מחזור התא התקין בתאים הצמחיים, וגורמים לחלוקה מוגברת של התאים המכילים את ה-T-DNA, וכך נוצר העפץ.

הנדסה גנטית בצמחים

גילוי ה-T-DNA היה הבסיס ליצירת צמחים מהונדסים (צמחים טרנסגניים). על-ידי הוצאת הגנים המקודדים ליצירת האנזימים המייצרים את האופינים ואת ההורמונים הצמחיים אפשר "להנדס" את ה-T-DNA כך שלא יגרום להתפתחות העפץ ולהפרשת האופּינים, אלא יבטא בתאים שאליהם הוכנס גנים אחרים שהוחדרו אליו. את הגנים אלה יש להחדיר לא לתאים שברקמה הפצועה, אלא לתאים שמהם נוצר אחר-כך צמח שלם. לפיכך פותחו שיטות להחדרת ה-T-DNA המהונדס לתאים צמחיים בתרביות רקמה. כדי להקל את העבודה המולקולרית נבנתה גרסה מוקטנת של הפלסמיד Ti, היכולה להתבטא גם בחיידק Escherichia coli, שבו יש נסיון רב בשיבוט של גנים.

קנט ברטון (Barton) היה הראשון, בתחילת שנות השמונים, שהחדיר גן זר לצמח. בשנת 1983 הצליחו ג'ון קמפ (Kamp) ועמיתיו להביא לביטוי גן המקודד יצירת חלבון תשמורת שמקורו בשעועית בצמח חמנית, באמצעות T-DNA.

בין הצמחים הראשונים שהונדסו בצורה מסחרית היו עגבניות בעלות חיי מדף ארוכים יותר. הגן שהוחדר לתאי תרבית הרקמה באמצעות ה-T-DNA היה גן שקודד RNA מול-קריא (antisense) של האנזים פוליגלקטורונאז (ובקיצור PG). PG מפרק פקטין, מרכיב מרכזי בדופן הצמחית. עיכוב פעילות ה-PG מעכב את התרככות הפירות. בתחילה יוצרו עגבניות אלה רק לצרכי תעשייה ובשנת 1994 אף אושרו לשיווק רגיל. אך החשש ממזון מהונדס גרם לכך שמשנת 2000 הם הפסיקו להמכר.

גם חברות הכימיקלים קפצו על העגלה והחלו להסתייע בצמחים שהונדסו גנטית באמצעות Ti כדי להגביר ייצור קוטלי עשבים מתוצרתם להלן שתי דוגמאות (לא בהכרח מייצגות):

הכימיקל גליפוזט (glyposate) קוטל עשבים (וחיידקים) על-ידי פגיעה בביוסינתזה של החומצות האמיניות החיוניות טריפטופן, ופנילאלנין, שהצמחים מסנתזים בעצמם ואילו בעלי-החיים צורכים במזון (אילו ביוסינתזה זו היתה מתרחשת גם בבעלי-חיים, היה אסור כמובן להשתמש בחומר זה כקוטל עשבים, כיוון שהיה קטלני ביותר גם לבעלי-חיים ולאדם). חברות שונות "הנדסו" צמחי טבק, סויה, כותנה ועגבניות עמידים לגליפוזט. מקורו של הגן לעמידות הוא במוטנטים עמידים לגליפוזט של חיידקי Salmonella.

אטרזין (atrazine) הוא חומר מעכב-פוטוסינתזה המשמש כקוטל עשבים בעיקר בשדות תירס, מאחר שצמחי התירס עמידים בפניו באופן טבעי. יצירת צמחי סויה טרנסגניים (או צמחים טרנסגניים אחרים) העמידים בפני אטרזין אפשרה להשתמש באטרזין גם בשטחי גידול סויה.

הרעלן של החיידק Bacillus thuringiensis קוטל חרקים האוכלים צמחים מהונדסים

החיידק Bacillus thuringiensis מוכר כבר משנת מ-1901 כקוטל מינים מסוימים של חרקים המזיקים לחקלאות, וזאת באמצעות רעלן שהוא מפריש. כבר מאז שנת 1920 היו חקלאים אורגנים שריססו את שדותיהם בחיידקים אלה, במקום כימיקלים להדברה. בשנות השמונים, עם עליית המודעות לחשיבות השמירה על הסביבה, התגבר מאד השימוש בתרסיסי החיידקים. ואולם, השימוש בחיידקים אלה היה כרוך בקושי, והוא שטיפתם עם מי הגשמים. באמצעות ה-T-DNA, החדירו החוקרים בשנת 1993 את הגן המקודד לרעלן לצמחי כותנה, ואכן, הם היו עמידים לזחלי ההֶליוטיס שניסו לאכול אותם. לאחר ההצלחה בכותנה, הועבר הגן גם לעגבניות ולתפוחי אדמה, ובטכנולוגיה אחרת (תותח גנים - gene gun) גם לצמחי תירס (שהם חד פסיגיים).

זן ישראלי של החיידק, B. thuringiensis israeliensis ,שבודד ב-1976 במעבדתו של פרופ' יואל מרגלית באוניברסיטת בן גוריון בנגב, נמצא קטלני במיוחד לזחלים של יתושים. אך על-כך, בפעם אחרת.

צמחים מהונדסים כיצרני חיסונים

האם אפשר להשתמש בטכניקות אלה לייצור צמחים מהונדסים שיבטאו חלבונים של נגיפים וחיידקים גורמי מחלות באדם, ושאכילתם תחסן את האוכל כנגד נגיפים או חיידקים אלה?

ובכן, הביוטכנולוגיה קיימת. אין מניעה טכנולוגית להחדיר, באמצעות T-DNA, חלבוני מעטפת של נגיפים או חיידקים לצמחי מאכל, דוגמת בננות ותפוחי-אדמה. אכילת צמחים אלה אכן עשויה לחסן את האוכלים, בתנאי שהחלבונים המבוטאים עמידים בפני החומציות הגבוהה (pH נמוך) שבקיבה, ויש משמעות חיסונית להחדרתם דרך הפה (כניגוד להזרקה לדם או לשריר). הסיבה שאין משתמשים בחיסונים כאלה היא אותה סיבה עצמה, שבעטיה ממעיטים כיום להשתמש במזון מהונדס. (בנושא זה דנו רבות ב"גליליאו": לדוגמה ראו יוסי הירשברג ואריה מעוז, "מי מפחד מצמחים מהונדסים", גליון 34, ורבקה ברג ויעקב ברג, "צמחים מהונדסים: סיכויים סיכונים והחקיקה שביניהם", גליון 83).

מחלת מורגלון - האם יש קשר בינה לבין A. tumefaciens?

מחלת מוֹרגֶלוֹן (Morgellon's disease) מוכרת זה שנים רבות מאוד: התיאור המתועד הראשון שלה הוא מ-1674. תסמיני המחלה הם פצעים דמויי עקיצה או נשיכת חרקים, שבבדיקה מיקרוסקופית מתגלים בהם סיבים בצבעים שונים, לרוב כחולים ולבנים, הן מתחת לעור והן בולטים מתוך הפצע החוצה. מלבד התסמינים העוריים, מלווה מחלה זו בתסמינים נוספים, ובהם חולשה כללית שלעתים אינה מאפשרת תפקוד יומיומי, כאבי פרקים וירידה בתפקודי המוח. התסמינים נצפו גם בכלבים, בחתולים ובסוסים. בארה"ב וקנדה ידוע על למעלה מ-2000 חולים. באירופה ואוסטרליה המספרים נמוכים יותר.

במשך שנים רבות היה מקובל לחשוב, כי מחלת מורגלון נובעת מסיבות פסיכיאטריות, אך בשנים האחרונות, גם בעקבות גילוי המחלה בבעלי-חיים, החלו לשקול ביתר רצינות גם סיבות אחרות. כיום סבורים שזוהי מחלה מדבקת שגורמים חיידקים, ואף הועלו שמות של חיידקים גורמי-מחלה אפשריים - Stenotrophomonas maltophila או Borrelia burgdorfery. הראשון מוכר כמזהם משני והשני כגורם מחלת ליים (Lyme disease), הנפוצה בצפון אמריקה. אף אחת מאפשרויות אלו לא אומתה עדיין. גם הרכב הסיבים עדיין לא ברור, אך יש עדויות נסיבתיות שאולי מדובר בתאית.

לאחרונה טען פרופ' ויטלי ציטובסקי (Citovsky) מאוניברסיטת סטוני-ברוק בניו-יורק, שבדיקות PCR של הסיבים גילו בהם חומר גנטי שמקורו ב-Agrobacterium tumefaciens. האם משמעות הממצאים היא, שהחיידק הוא הגורם למחלה? ימים יגידו. אף שציטובסקי עצמו טוען שאין קשר בין מחלת מורגלון לבין מזון מהונדס, ושהקשר שמצא הוא בין המחלה לבין חיידק המצוי בכל מקום באדמה, הרי שמתנגדי השימוש בהנדסה גנטית מבססים על תגליתו את הטענה שמזון מהונדס הוא האחראי למחלה. אנו נסתפק בכך שנזכיר, שהמחלה מוכרת כבר למעלה מ-300 שנה, ואילו הנדסה גנטית בצמחים קיימת זה 30 שנה בלבד.

לסיכום

המערכת הטבעית של העברת ה-T-DNA מחיידקי Agrobacterium tumefaciens משמשת היום ככלי יעיל ביותר לשינוי ולשיפור צמחים, ומאפשרת עקרונית גם יצירת חיסונים לבני-אדם. החשש מפני טכנולוגיות ההנדסה הגנטית מעכב רבים מיישומיהן האפשריים.

לקריאה נוספת:
רבקה ברג ועקב ברג, "צמחים מהונדסים: סיכויים סיכונים והחקיקה שביניהם", "גליליאו" 83, 2005.

"מי מפחד מצמחים מהונדסים", יוסי הירשברג ואריה מעוז, "גליליאו" 34, 1999.

"צמחים מהונדסים", ידידיה גפני, "גליליאו" 13, 1995.

"החדרת גנים חדשים לצמחים", ידידיה גפני, "מדע" כרך ל(2), 1986:

 פורסם במקור ב"גליליאו" גיליון 119, עמ' 83-80, יולי 2008.